miR-491对肾上腺皮质癌细胞的影响

分类：医学校验论文发表 时间：2019-10-26 10:25 关注：(1)

　　目的微小RNA结合mRNA的3′非翻译区(3′-UTR)，在转录后调节基因表达并在癌症发展中起重要作用。本研究探讨miR-491在肾上腺皮质癌(adreenocortical，ACC)中作用。方法CCK-8实验评估miR-491对ACC细胞增殖影响，细胞划痕和Transwell实验检测ACC细胞迁移和侵袭能力;流式细胞仪检测miR-491对ACC细胞周期影响。结果转染72h后，H295R细胞中miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组A值分别为0.73±0.06和0.95±0.04，t=5.356，P=0.001;SW13细胞中miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组A值分别为0.78±0.05和0.97±0.04，t=3.274，P=0.031。H295R细胞中miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组侵袭数分别为33.24±2.02和70.56±2.63，t=19.543，P=0.004;miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组细胞迁移距离分别为0.74±0.03和1.26±0.07，t=11.832，P=0.002。SW13细胞中miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组侵袭数分别为42.25±3.21和78.56±2.93，t=14.943，P=0.001;miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组细胞迁移距离分别为0.85±0.04和1.46±0.08，t=11.812，P=0.003。H295R细胞中miR-NCmimic组G1/G0期和S期细胞占细胞总数比例分别为(81.17±3.63)%和(9.86±2.13)%，miR-491mimic组分别为(56.60±1.63)%和(29.91±1.83)%，t值分别为12.482和10.463，均P<0.001。结论miR-491上调促进了ACC细胞增殖、侵袭和迁移能力，miR-491可能在ACC中充当致癌基因。

　　【关键词】miR-491;肾上腺皮质癌;细胞增殖;迁移

　　肾上腺皮质癌(adreenocortical，ACC)是一种罕见且具有侵袭性的恶性肿瘤，患者预后较差，多数患者术后出现局部复发和远处转移，5年生存率为15%～30%[1]。目前，局部ACC唯一治愈方法是完全肿瘤切除术。近年来，miRNA作为评估肿瘤的生物标志物受到越来越多关注[2]。miRNA可调节基因表达，在许多生物途径和病理过程中具有关键作用。miRNA在很多癌症类型中失调，包括ACC[3]。DNA微阵列谱研究表明，miRNA在组织和恶性肾上腺皮质肿瘤中表达不同[4]。最新研究表明，miRNA不仅在ACC中失调，也可能作为潜在的预后标志物[5]。组织样本中miR-491表达水平与ACC患者预后不良相关[6]。在ACC患者和正常肾上腺中，miR-491表达是上调的[7]。本研究评估miR-491在ACC细胞中表达和生物学功能，进一步揭示其内在抗肿瘤机制。

　　1材料与方法

　　1.1细胞系及其培养

　　人ACC细胞系NCI-H295R(H295R)和SW13购自美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCollec-tion，ATCC)。H295R细胞(ATCCCRL-2128)在含有体积分数为5%胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)和1%ITS+Premix补充物的DMEM/F12中培养。SW-13细胞(ATCCCCL-105)在10%FBS的Leibo-vitz培养基中培养。37℃、5%CO2培养。

　　1.2主要试剂与仪器

　　Lipofectamine2000和FBS购自美国Invitrogen公司，MTTSolution购自美国Sigma公司，AB7500实时PCR生物系统仪器购自美国应用生物系统公司，Gibco胎牛血清、NanodropND-2000和反转录试剂盒购自美国赛默飞公司，高效RIPR裂解液购自北京索莱宝科技有限公司，BDCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。

　　1.3方法

　　1.3.1实验分组及处理实验分为miR-NCmimic组和miR-491mimic组，miR-NCmimic上游引物序列为5′-UUCUCCCAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列为5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′;miR-491mimic上游引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGAGT-GGGGAACCCTTCC-3′，下游引物序列为5′-TGGT-GTCGTGGAGTCG-3′。将这两组分别转染至H295R和SW13细胞中进行后续实验。1.3.2qRT-PCR检测H295R和SW13细胞中miR-491表达使用Trizol试剂，根据说明书操作，从ACC细胞系(H295R和SW13)中分别提取总RNA。使用NanoDrop2000c测量RNA浓度后，使用miScriptⅡRT试剂盒，将RNA逆转录成cDNA，进行qRT-PCR。10μL反应混合物由5μL2XQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix，3.7μL无RNase水，1μLcDNA模板，0.4μL特异性miRNA引物和10XmiScriptUniver-salPrimer组成。miR-491模拟物miR-491mimic上游引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGAGTGGGGAAC-CCTTCC-3′，下游引物序列为5′-TGGTGTCGTGGAG-TCG-3′，miR-NCmimic上游引物序列为5′-UUCUCCC-AACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列为5′-ACGU-GACACGUUCGGAGAATT-3′由上海吉玛生物公司合成;U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-A-3′，下游引物序列为5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。使用2-ΔΔCq方法分析细胞中miR-491表达水平。1.3.3细胞转染转染前1d，将细胞无血清培养基中接种0.5～2×105个细胞，转染时细胞密度达到90%。首先使用50μL无血清的Opti-MEM低血清的培养基稀释DNA，轻轻混匀。Lipofectamine2000以及DNA稀释液混匀在室温静置20min，加入混合液100μL，37℃孵育24～48h。转染24h后，将细胞以1∶10稀释浓度转移到新培养基中。1.3.4CCK-8测定细胞增殖使用CCK-8测定法评估H295R和SW13细胞增殖能力。将细胞接种在96孔板中，5000个细胞/孔，分别用miR-491mimics和miR-NCmimics转染。向每个孔中加入10μLCCK-8溶液，37℃、5%CO2培养30min。将细胞孵育0、24、48和72h后，使用酶标仪测量450nm处A值。1.3.5细胞划痕实验按照1×106个/孔接种细胞，饥饿处理24h后，用miR-491mimics和miR-NCmimics转染细胞。细胞转染后，在37℃无血清和抗生素的培养基中培养24h。然后通过拖动无菌移液管尖端造成划痕。使用相机系统在0、12和24h，37℃下捕获细胞划痕图像。1.3.6Transwell实验使用24孔Transwell小室评估H295R和SW13细胞迁移和侵袭能力。转染后24h，将约3×104细胞铺在上室中。Transwell下室含有600μL补充有10%FBS和1%谷氨酰胺的培养基(DMEM或RPMI1640)。在48h，使用0.1%多聚甲醛将细胞固定25min，并使用4%结晶紫在室温下染色25min。在4个随机选择的视野中对细胞进行计数。1.3.7细胞周期分析收获1×106个细胞，用70%乙醇固定过夜。然后将细胞用含有RnaseI(100μg/mL)和碘化丙锭(50μg/mL)，以及含有0.1%TritonX-100的PBS，37℃染色30min，通过流式细胞术进行细胞周期分析。1.4统计学方法采用SPSS16.0对数据进行统计学分析，正态性计量资料以x-±s表示，比较采用t检验，用GraphPadPrism软件绘图。检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1ACC细胞miR-491表达水平

　　ACC细胞中存在miR-491表达。H295R和SW13细胞中miR-491相对表达量分别为2.88±0.21和3.52±0.32，n=3。

　　2.2miR-491上调对H295R和SW13细胞增殖能力影响

　　表1示，转染72h后，H295R细胞中miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组A值分别为0.73±0.06和0.95±0.04，t=5.356，P=0.001;SW13细胞中miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组A值分别为0.78±0.05和0.97±0.04，t=3.274，P=0.031。说明miR-491上调可分别促进H295R和SW13细胞增殖能力。

　　2.3miR-491上调对H295R和SW13细胞侵袭和迁移能力影响

　　H295R细胞中miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组侵袭数分别为33.24±2.02和70.56±2.63，t=19.543，P=0.004;miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组细胞迁移距离分别为0.74±0.03和1.26±0.07，t=11.832，P=0.002。SW13细胞miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组侵袭数分别为42.25±3.21和78.56±2.93，t=14.943，P=0.001，miR-NCmimic组和转染miR-491mimic组细胞迁移距离分别为0.85±0.04和1.46±0.08，t=11.812，P=0.003。

　　2.4miR-491上调对H295R细胞周期影响

　　图1示，miR-NCmimic组G1/G0期、S期和G2/M期细胞占细胞总数比例分别为(81.17±3.63)%、(9.86±2.13)%和(8.96±3.53)%，miR-491mimic组分别为(56.60±1.63)%、(29.91±1.83)%和(13.49±1.68)%，t值分别为12.482、10.463和1.823，P值分别为<0.001，<0.001和0.142，提示与miR-NCmimic组相比，转染miR-491mimic组H295R细胞G1/G0期细胞比例降低，S期细胞比例升高。

　　3讨论

　　ACC是一种罕见恶性肿瘤，临床治疗效果预后不良。基础研究中通过表达谱数据与外显子组测序、SNP阵列分析、甲基化和miRNA研究分析，对肿瘤中分子机制研究和临床治疗有较好的指导价值[8]。一些miRNA已被证明具有潜在的诊断和预后价值，随着疾病特异性miRNA的出现，miRNA可能是恶性肿瘤生物标志物。但是，仍然还有很多问题待解决，文献中报道的大多数miRNA尚未在研究中得到验证[9]。miRNA是一种小型非编码RNA，通过靶向降解mRNA或者抑制转录后翻译过程，导致靶基因沉默。miRNA-RISC复合物与靶mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)中的序列互补，导致mRNA降解以及蛋白质翻译过程受到抑制。许多miRNA表现出组织特异性表达，miRNA在组织和器官发育过程中起关键作用[10]。每个miRNA可以控制数百个基因，单个转录本可以携带几个miRNA结合位点[11]。由于其潜在的多靶点作用，miRNA会参与调节生物学机制，影响癌症发生发展，确定miRNA特征与肿瘤之间关系有助于理解肿瘤发展机制并指导临床治疗策略[12]。有研究报道，miR-491表达水平在结肠癌旁组织中显著高于结肠癌组织[13]。然而，结肠癌旁组织中PEG10、Wnt1和β-连环蛋白水平较低，表明PEG10可能受miR-491调节。PEG10激活Wnt/β-catenin信号通路，其过表达后细胞增殖水平升高[14]。姜黄素处理HCT-116细胞后可以增加miR-491表达，抑制PEG10表达，同时，沉默PEG10导致Wnt1和β-catenin减少，促进HCT-116细胞凋亡，抑制细胞增殖[15]。除此之外，miR-491直接靶向TRIM28在体外调节胶质瘤细胞增殖活性。本研究结果显示，上调miR-491可促进H295R和SW13细胞增殖，促进H295R和SW13细胞侵袭和迁移，并影响H295R细胞周期，可能通过改变ACC细胞周期影响癌细胞发生和发展。综上所述，miR-491可能在ACC中起致癌基因的作用，miR-491可能作为ACC表型标志物，但ACC中miR-491具体相关靶点未能确定，具体机制还需要进一步研究。未来的研究需要更好地表征miR-491与上游和下游途径效应之间的关系，以及测试miR-491在转移性ACC中的诊断和治疗效果。

　　作者：苏珂 杨旭光 单位：郑州人民医院内分泌科