转基因小鼠脑组织表达意义

分类：医学校验论文发表 时间：2020-04-02 11:59 关注：(1)

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　　关键词：转基因；组织

　　1资料及方法

　　1.1动物模型和取材野生型（wildtype，WT）小鼠由陆军军医大学大坪医院实验动物中心提供。含P301L突变的转基因小鼠（pR5小鼠）由澳大利亚昆士兰大学脑研究所提供。在陆军军医大学大坪医院实验动物中心繁殖和饲养。本研究符合陆军军医大学大坪医院实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准。分别取9月龄野生型小鼠和9月龄含P301L突变的转基因小鼠（pR5小鼠）各10只用于研究。小鼠用水合氯醛麻醉，每只小鼠开胸暴露心脏后用灌注针经左心室快速注入生理盐水150mL，立即断头取脑，一半脑组织放入4%多聚甲醛和0.1mmol/LPBS后固定6~8h，用0.1mmol/LPBS充分冲洗后，放入冰冻切片机内进行冠状位连续切片，切片厚度为30μm，放入-4℃冰箱保存，为免疫荧光实验备用；另一半脑组织冰上小心快速分离出大脑（含皮质及海马）组织后，迅速放入-80℃中保存，为免疫印迹实验备用。1.2主要试剂蛋白定量试剂盒购自ThermoScientific公司。兔抗CX3CL1抗体为Abcam产品，小鼠抗内参β-actin抗体购自Sigma公司，抗磷酸化tau蛋白抗体为Phospho-Tau（Ser202，Thr205）MonoclonalAntibody，购自ThermoScientific公司，二抗为IRDye-800CW山羊抗兔、IRDye-800CW山羊抗小鼠，购自Li-cor公司。1.3检测方法1.3.1Westernblot检测将取材的小鼠脑组织放入研钵中，加入液氮后于冰上研磨，待成浆液状后加入总蛋白提取液（碧云天公司），按操作说明进行。提取物经低温高速离心后，提取上清，保存于-80℃低温冰箱中备用。行Westernblot检测时，将总蛋白样品经BCA蛋白定量试剂盒（ThermoScientific公司）定量，取30μg加入5×LoadingBuffer（碧云天公司）后进行电泳、转膜。然后分别加入兔抗CX3CL1一抗（1∶500，Abcam公司）和小鼠抗β-actin（1∶3000）一抗，4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10min，分别加入二抗（山羊抗兔、山羊抗小鼠），室温2h，TBST洗膜3次，每次10min，在ODSEY仪器扫膜。分别得出CX3CL1与β-actin条带荧光强度的比值用于统计分析。1.3.2免疫荧光从冰箱中取出，用PBS冲洗3遍，加0.4%的TritonX-100，室温15min；PBS冲洗5min×3次，滴加封闭血清封闭，置于37℃恒温孵育箱孵育30min；甩去多余封闭血清，滴加一抗（兔抗CX3CL1和小鼠抗磷酸化tau蛋白[Phospho-Tau（Ser202，Thr205）MonoclonalAntibody）]，置于4℃冰箱内过夜，PBS洗5min×3次；避光加入二抗，37℃恒温孵育箱避光孵育60min；二抗为AlexaFluor488标记驴抗兔IgG和AlexaFluor594标记驴抗小鼠，PBS洗5min×3次，甘油-PBS（1∶1）封片后荧光显微镜观察荧光双标表达并采集图片。1.4统计学处理统计分析采用GraphPadPrism5.0软件，数据均采用均数±标准差（x±s）表示，采用独立样本t检验方法检验2组小鼠脑组织中CX3CL1的表达水平，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1CX3CL1在pR5小鼠脑组织中表达升高运用Westernblot测定CX3CL1条带为95kD，内参β-actin条带为42kD（图1），测定CX3CL1在WT小鼠脑组织中和pR5小鼠脑组织中的表达，CX3CL1在WT小鼠脑组织中表达低，而在pR5小鼠脑组织表达升高。2组之间的平均光密度值有统计学差异（1.09±0.23vs.0.61±0.14，t=5.340，P=0.000），如图1所示。2.2CX3CL1和磷酸化tau蛋白在pR5小鼠脑组织中共表达运用免疫荧光双标方法，发现CX3CL1与磷酸化tau蛋白在转基因小鼠脑组织中同一部位表达（图2）。因此，CX3CL1在含P301L转基因小鼠脑组织中，与磷酸化tau共表达。

　　3讨论

　　本研究结果表明CX3CL1与p-tau在含突变P301L转基因小鼠脑组织中共表达，CX3CL1在pR5小鼠脑组织中表达上调。该结果支持中枢神经炎症机制在p-tau病理中起重要作用[7-8]，CX3CL1在调控tau磷酸化中发挥重要作用[9]。炎症趋化因子CX3CL1是第4代趋化因子，是CX3C类趋化因子家族唯一的成员，命名为CX3CL1[10]，其受体为CX3CR1。CX3CL1有膜结合型和分泌型2种形式[10]。在中枢神经系统，CX3CL1主要表达于神经元，其唯一的受体CX3CR1位于小胶质细胞。CX3CL1具有独特的结构、多种性质和细胞表达模式，CX3CL1参与神经元、神经元和小胶质细胞间的细胞间通讯[11]。CX3CL1作为神经调节蛋白，参与神经退行性疾病等中枢神经系统疾病[12-13]，在小胶质细胞活化、tau病理中发挥重要作用[13-14]。CX3CL1/CX3CR1信号轴在小胶质细胞吞噬tau机制中起重要作用[9，15]，CX3CL1/CX3CR1信号缺失导致小胶质细胞对tau的吞噬反应改变，体内外实验发现敲除CX3CR1导致小胶质细胞对tau的摄取和降解功能受损[9]，tau和CX3CL1竞争性地与CX3CR1结合，tau与CX3CR1结合引起小胶质细胞对tau的内吞，但p-tau可以降低与CX3CR1的亲和力。在小鼠模型中，炎症趋化因子CX3CL1可以减轻小胶质细胞活性，CX3CR1缺失的小鼠实验显示CX3CL1信号可以减少tau病理。过表达可溶性CX3CL1可以明显减少rTg4510小鼠模型中的tau病理沉积，减少小胶质细胞活化，阻止神经退行性改变[15]。含人tau-P301L突变的海马HT22细胞中有CX3CL1表达，CX3CL1信号可以激活转录因子NRF2-ARE并减轻tau-P301L导致的微神经胶质瘤[16]。细胞培养模型显示促炎症因子可以引发磷酸化tau，通过调节小胶质细胞和神经元的相互作用从而影响小胶质细胞活化，小胶质细胞活化可以加速恶化磷酸化tau[17]。CX3CL1还可以通过抑制炎症因子如肿瘤坏死因子-α，促炎症因子白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6炎症因子的产生[18]，通过减少炎症反应从而限制微神经胶质增生[16]。有研究报道小胶质细胞活化可能通过CX3CL1信号促进磷酸化tau水平，CX3CL1信号依赖与炎症因子的相互作用，主要是炎症因子IL-6[19]。本研究发现WT小鼠脑组织中有一定的CX3CL1表达，而pR5小鼠脑组织中CX3CL1表达上调。有报道CX3CL1及其受体在5XFAD模型小鼠视网膜中表达上调[20]。另有研究表明CX3CL1蛋白水平在AD患者海马中表达上调，且与tau病理改变相关[9，16]。本实验结果显示，9月龄野生型小鼠脑组织中有CX3CL1的表达，而9月龄pR5小鼠脑组织中有大量CX3CL1表达，同时CX3CL1与p-tau蛋白通过免疫荧光共表达。本研究结果显示，含突变P301L转基因小鼠脑组织中CX3CL1的表达上调，可能与磷酸化tau有关，但CX3CL1与磷酸化tau的关系及机制仍需进一步研究。

　　作者：徐亚丽 孙彬录 姚莉 何小蓉 曾桂花 邓霞 江漫春 甘丹 张兴平 单位：重庆市人民医院老年病科 陆军军医大学大坪医院神经内科 重庆市人民医院健康管理中心 重庆市人民医院科教处