重组结核分枝杆菌Mr 38 000蛋白的表达、纯化和鉴定

分类：预防医学论文发表 时间：2013-10-28 16:49 关注：(1)

　　摘要 从H37Rv基因组中扩增Mr38 000 蛋白基因并高效表达和纯化。用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Mr 38 000蛋白序列，将其与pGEM-T-Easy 载体连接转化E.coli DH5α，构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/ Mr 38 000，测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coli DH5α，IPTG诱导目的蛋白表达。 经Western-blot 鉴定目的基因与(His)6融合表达，将已表达的蛋白质通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化。PCR得到结核分枝杆菌Mr 38 000蛋白基因，测序结果与GeBank 中报道的完全一致。SDS-PAGE显示， 在Mr为38.5×103处有相应的蛋白质表达条带，Wesern blot鉴定为(His)6融合表达蛋白。经Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白。成功克隆了铁调节蛋白基因Mr38 000 蛋白序列，并在E.coli DH5α高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白。

　　关键词 Mr 38 000蛋白; 表达; 纯化; 结核分枝杆菌;

　　结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)是结核病(tuberculosis, TB)的病原体。其在患者体内主要为细胞内生长。诊断方法的欠缺是结核病流行的重要原因。 目前常用的PPD试验，常使BCG疫苗接种者被误检为阳性[1]，且对后期结核患者敏感性较低，存在明显不足。近年来， 有研究发现Mr 38 000 蛋白具有强的免疫原性，而成为结核分枝杆菌抗原的研究热点[2, 3]，可能成为结核病血清学诊断试剂和疫苗研究的候选抗原之一。为此，我们在原核表达载体中表达结核分枝杆菌 Mr 38 000蛋白并对其进行了纯化，为进一步研究其抗原性和主要功能提供方便。

　　1　材料和方法

　　1.1材料 　MTB毒株H37Rv、 DH5α由本室保存; pGEM-T-Easy及Wizard Plus Purification system购自Promega公司;X-gal， 限制性内切酶BamHⅠ, EcoRⅠ及T4-DNA连接酶，TaqDNA聚合酶均为TaKaRa公司产品;IPTG, DTT, DTE, 小量质粒提取试剂盒均为Sigma公司产品，胶回收试剂盒为Vitagene公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物的设计与合成 根据已发表的MTB H37Rv全基因组Mr 38 000 蛋白基因序列设计引物。上游引物P1: 5’-AGGGGATCCGCGAAAATTCGTTTGCATACGCT-3’，含BamHⅠ酶切位点和起始密码子， 下游引物P2:5’-GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG-3’ 中加入EcoRⅠ酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

　　1.2.2 Mr 38 000片段的扩增 取保存于改良罗氏培养基的MTB H37Rv接种于7H9液体培养基，37℃间或振荡培养2~3 wk。取5mL液体培养物的菌体沉淀重悬于50μL裂解液(10╳PCR绶冲液5μL, 45 g/L吐温， 5μL, 45 g/L, NP-40 5μL，20 g/L蛋白酶K 0.5μL及水34.5μL)中。于55℃水浴1 h，沸水浴10 min灭活蛋白酶K，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50μL TE中， 作为DNA模板。PCR反应体系为：10╳buffer 5μL, dNTPs 5μL (2.5mmoL/L)、DNA模板为1μL，P1，P2 引物各1μL (25μmoL/L)及Taq酶1μL，加水至50μL。PCR条件：94℃变性40 s，60℃复性30 s，72℃延伸1.5 min， 30个循环。

　　1.2.3 PCR产物的克隆与鉴定 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收DNA条带。取纯化的PCR产物与质粒pGEM-T-Easy进行连接反应，转化感受态DH5α， 均匀涂布于含有x-gal (33μL) 和异丙基β-D硫代半乳糖苷IPTG (20μL)的LB培养皿中，37℃培养16 h， 挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGEM-T-Easy- Mr 38 000，送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

　　1.2.4 目的蛋白的诱导表达 经BamHI和EcoRⅠ双酶切后与经同样酶切的pQE-80L载体进行连接反应， 转化感受态DH5α，挑取的阳性克隆命名为pQE-80L -Mr38 000。在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中过夜培养pQE-80L- Mr 38 000。按10%的接种量进行转接，37℃摇菌3 h，加入异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5 mmoL/ L，37℃继续培养4~5 h。取1.5 mL细菌培养物，8000 g离心30 s收集菌体，加入2╳样品缓冲液剧烈振荡混匀，100℃, 5 min;8000 g离心5 min;取上清进行 SDS-PAGE电泳检测。

　　1.2.5 目的蛋白的Western blot分析 将经诱导的pQE-80L-Mr 38 000和E.coli DH5α分别制样，进行12% SDS-PAGE后以0.15 mA恒流电转2 h至硝酸纤维素膜上，用50 g /L脱脂奶封闭2 h，PBS洗涤后加抗His的单克隆抗体(1:5000稀释) 4℃过夜，PBS洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1 h。PBS洗涤后DAB显色观察结果。

　　1.2.6 目的蛋白的可溶性分析 大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集细菌，超声破菌。离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDS-PAGE分析。

　　1.2.7 目的蛋白的纯化 根据Ni-NTA试剂盒的说明书， 将融合蛋白与NI-NTA结合， 用不同pH值咪唑溶液进行洗脱， 得到纯化产物。