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论述Survivin shRNA真核表达载体的构建生物学作用

期刊目录网预防医学论文发表2013-12-08 16:46关注(1)

  【摘要】 流式细胞术结果流式细胞术检测显示转染组中G2/M期细胞的比率升高. 错义序列组和脂质体对照组中,MCF?7细胞的细胞周期未出现上述变化(图2),表明shRNA表达载体的转染对MCF?7细胞的增殖具有抑制作用,与MTT比色法检测的结果相符.

  【关键词】 survivin; RNA干扰; shRNA

  0引言

  存活素(survivin)基因几乎表达于所有常见的人类肿瘤组织,尤见于乳腺癌和肺癌[1]. 有研究证明将小于30个核苷酸的小干扰RNA(small interferencing RNA, siRNA)或短发夹RNA(shRNA)表达载体转入哺乳动物细胞中,同样能产生沉默效应. 目前 ,其载体构建大多是用RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子U6或H1进行表达的[2-3],但是用RNA polⅡ依赖的巨细胞病毒立即早期启动子同样有效[4]. 本实验我们设计针对survivin基因的shRNA表达质粒,将其转染人乳腺癌MCF?7细胞,初步探讨其诱导MCF?7细胞凋亡情况及对survivin基因表达的 影响 .

  1材料和方法

  1.1材料pShuttle 1.0?CMV载体(产地ambion公司);Lipofectamine 2000转染试剂盒(invitrogen);各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶(大连宝生物公司);总RNA提取试剂盒(加拿大BioBasic公司);逆转录聚合酶链反应( RT?PCR)试剂盒(美国Qiagen公司).

  1.2方法

  1.2.1shRNA的设计根据survivin基因的序列在线设计3个可干扰序列: ① 5′?GGACCACCGC ATCTCTACATTCAAGAAC?3′, ②5′?ACAGAGAAAG AGCCAAGAACAAA?3′, ③5′?AATTTGA GGAAACTGCGGAGA?3′和一个错义序列5′?TATGAGAATGGCAGCGA GATA?3′(其碱基组成同序列③,但排列顺序不同),同源 分析 未见相同序列.

  1.2.2重组质粒的构建和鉴定shRNA转录模板DNA链的设计: 按pShuttle 1.0?CMV载体要求以反向重复方式设计发夹结构:正义链:5′?CTAGT反向序列TCTCTTGAA正向序列C?3′,反义链:5′?TCGAG正向序列TTCAAGAGA反向序列A?3′. 重组质粒的构建:模板链合成并退火,将其定向克隆至穿梭载体pShuttle 1.0?CMV中;转化DH5α感受态细胞,氨苄青霉素筛选单克隆,分别命名为pShuttle?survivin(1?3)和pShuttle?control. 重组质粒的鉴定:提取质粒分别用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切,取初步鉴定的质粒送上海生物工程技术服务有限公司测序.

  1.2.3细胞培养与转染乳腺癌细胞株MCF?7用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液培养于37℃含50 mL/L CO2的培养箱中. 转染前24 h将约1×105个细胞接种至6孔板,转染时细胞融合度达30%~50%. 按Lipofectamine 2000操作手册进行转染:用质粒pShuttle?survivin(1?3)以50 nmol/L的浓度分别转染细胞,设立阴性(加pShuttle?control)和空白对照组(加Lipofectamine 2000),每组设3个平行孔,培养24 h后行MTT检测,筛选出最有效的shRNA表达质粒,将最有效的质粒分别以5,10,50,100,150 nmol/L的终浓度转染MCF?7细胞,每组设3个平行孔,设立对照组,培养24 h后再次行MTT检测[5].

  1.2.4流式细胞术检测接种MCF?7细胞于60 mm平皿中(2×106/皿). 接种后24 h,以最有效质粒的最佳浓度转染细胞,设阴性和空白对照组. 转染后48 h收集细胞,1000 r/min离心5 min,弃上清,PBS清洗1次,离心去PBS,加入预冷的700 mL/L的乙醇,4℃固定16 h以上. 离心去乙醇,PBS清洗1次,加0.5 mL 50 mg/L PI(含100 mg/L RNase A)于避光处染色30 min,用Coulter EPTCSXL?31240流式细胞仪进行检测.

  1.2.5Hoechst荧光染色检测凋亡取普通洁净盖玻片于750 mL/L乙醇中浸泡24 h以上,风干,将盖玻片置于六孔板内,种入MCF?7细胞培养过夜. 加入含最有效质粒的最佳浓度的培养基,作用24 h,设阴性和空白对照组. 吸尽培养液,加入0.5 mL固定液,4℃固定过夜. 去固定液,用PBS洗两遍,每次3 min,吸尽液体. 加入0.5 mL Hoechst 33258染色液,摇床上染色5 min. 用PBS洗两遍,每次3 min. 加一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,使细胞接触封片液,荧光显微镜检测.

  1.2.6RT?PCR检测按一步法RT?PCR试剂盒说明书提取RNA后行PCR. survivin基因引物(产物为166 bp)P1:5′?cagatttgaatcgcgggaccc?3′,P2:5′?ccaagtctggctcgt tctcag?3′;GAPDH 引物(产物为280 bp)P1:5′?gtagaggcag ggatgatgttc?3′,P2:5′?gagttag ctcactcattaggc?3′. 反应条件:50℃反转录30 min;95℃初始PCR激活反应15 min;94℃变性0.5 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min;共35个循环;72℃反应延伸10 min. 取PCR产物3 μL于10 g/L琼脂糖凝胶电泳.

  1.2.7Western Blot检测细胞转染后48 h提取总蛋白,经Bradford法测定蛋白浓度,设立空白和阴性对照. 每组分别取20 μg用以检测内参β?actin蛋白质,取60 μg以检测Survivin蛋白,蛋白经100 g/L SDS?PAGE电泳,100 V电转1 h,100 g/L脱脂奶封闭过夜. 在装有抗Survivin抗体和PVDF膜的袋中室温下摇动2 h,洗膜后加入二抗,室温下摇动1 h. 增强化学发光显色曝光.

  统计学处理:采用SAS8.0软件包进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义.

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